单细胞基因组的扩增与文库的构建2022-04-29 09:08:51
对于一些临床样本,比如经历过像移植这种长时间的流程后取下的组织样本,或是从尸体上采集的样本,单核转录组测序技术则是一个更好的选择。该方法利用了细胞核在反复冻融过程中的抗降解能力,同时也可以规避因细胞体积过大而产生的捕获困难。利用此项技术SEE等发现, 长基因间非编码RNA是调控小鼠CMs细胞周期的关键因子。虽然snRNA-seq作为scRNAseq的补充具有一定的优势, 但是其局限性也不可忽视。已知大多数基因主要定位于细胞质中, 但仍有一部分基因在细胞核中有更多的转录本。使用snRNA-seq进行分析时, 这些核富集的转录本可能会导致细胞周期、转录和泛素周期等生物过程被过度强调。因此, 仅测量核mRNA的表达也可能会导致基因转录本相对丰度的失真, 影响细胞类型识别和细胞聚类。相信随着单细胞水平研究的不断深入,根据不同的实验设计和目的需求, 相应的平台技术流程也会随之优化和进步。在成功分离和捕获目的细胞之后,需要生成相应的文库,即在裂解细胞获得RNA后将其反转录为cDNA。值得注意的是,由于细胞中mRNA的含量一般较低, 需要在逆转录后对cDNA进行预扩增, 通常通过PCR扩增, 或是多重线性扩增等来实现。SMART-seq2等线性扩增的方式能够有效地解决PCR指数扩增造成的偏差, 同时具有较高的灵敏度和较好的文库产量, 也在降低成本的基础上缩短了扩增时间。在有大量细胞分析需求时, DROP-seq则是很好的选择, 其通过微流控装置将单个细胞包裹在带有DNA条形码微珠的纳升级液滴中, 这些条形码随后会连接到逆转录的cDNA上, 由此对数以千计的细胞进行平行分析。已有研究团队利用Drop-seq对小鼠胚胎干细胞进行细胞群解构分析, 发现在白血病抑制因子戒断后细胞分化的异质性。近年来,出现了将Drop-seq和10×Genomics Chromium相结合的方法,其通过微流体墨盒形成的纳升级液滴, 将单个细胞置于油基介质中, 以分离细胞进行微反应, 这是目前最高通量的方法, 一次可评估成千上万个细胞。但是, 基于Drop-seq的扩增手段也存在着一定的局限, 比如读取深度较浅, 无法对可变剪切等进行深入的研究。目前认为, 其更适合鉴定罕见的细胞群, 或研究整个器官水平的细胞多样性。
出自《单细胞技术与干细胞疗法在心脏疾病研究中的应用》作者凤琦，王利。
上一篇： 单细胞样品的制备和单细胞的捕获
