单细胞分离与准备

单细胞分离方法因所用的单细胞测序技术和细胞来源而异。 对于培养细胞,可以通过常规的细胞解离方法制备。 但对于组织,则需要用酶仔细消化,特别是对于脆弱或易于死亡的细胞群。 单细胞分离后,需要立即用染料标记活细胞,然后用流式细胞荧光分选技术阳性选择活细胞（或用核酸结合染料与双链核酸结合,FACS 阴性选择活细胞）。体积较小的人胎儿心肌细胞较容易被基于微滴的单细胞测序技术平台（微滴直径40 μm）获取。成人心肌细胞（直径约 100 μm）主要是通过基于板或微流体的单细胞测序技术平台（直径 130 μm）获取,但这会造成心肌细胞的损伤。 对于成人心肌细胞,还可以分离出单细胞的细胞核,用细胞核测序。 最近有研究表明,可通过直径为 500 μm 的大颗粒流式细胞仪用于成人心肌细胞的单细胞测序分析。
 

质量控制与归一化

用转录组测序的通用的序列对齐软件 STAR 将产生的原始测序数据与公开可用的平台序列（ 如 10xGenomics 的 Cell Ranger） 对齐,产生特征条形码矩阵（feature-barcode matrices）。 其 他 预 处 理 软 件, 例 如dropEst、Dr. seq2 和 scPipe,也可用于生成表达矩阵。

一些用于处理转录组测序数据的软件,如 FastQC 或RNA-SeQC,也可用于处理单细胞测序数据。 对齐后,可以使用许多 R 包或 python 包进行数据的质量控制、可视化和分析。 迄今为止,Monocle、Scanpy、Scater、Scell、Seurat 和 Sincera 软件包最常用于单细胞基因表达分析。 与其他细胞相比,心肌细胞的线粒体含量较高。
 

降维

单个维表示单个基因的表达,单细胞测序数据是多维的,为了后续的可视化和分析,就需要降维。 迄今为止,已有很多降维和聚类的算法,但并无一种是金标准,在选择算法时,需考虑计算上和生物学上的优缺点,选择合适的算法。 随着基于液滴的单细胞测序技术的出现,捕获细胞的能力越来越好,生成的数据集不断增大,从而提供了更好的提高识别稀有细胞群的能力。 此外,由于高度的缺失和噪声,使得主成分分析等线性变换无法捕获细胞关系,非线性降维算法（如 t-分布领域嵌入算法和统一流形逼近与投影）,因其灵活性和更易于生成可视化结果而变得越来越流行。
 

出自《单细胞测序在心血管系统中的应用》作者潘乐,汪翔,龚惠。