单细胞基因组扩增方法2021-09-24 08:47:01
单细胞全基因组扩增是单细胞测序技术的关键环节。典型的动物细胞内mRNA含量约为0.5pg, 远低于进行深度测序所需的DNA含量（＞200 ng）,因此需要在进行反转录后, 进行cDNA扩增。目前已知的扩增方法主要基于3种扩增策略, 包括PCR指数扩增、phi29DNA聚合酶扩增、体外转录（in vitro transcription, IVT）线性扩增; 方法包括Brady法、Smart-seq2、STRT-seq、SCRB-seq、DROP-seq、cel-seq等。TANG等在Brady法上进行改进, 提高了覆盖率, 从小鼠胚胎干细胞内检测到了10815个基因; 利用IVT方式进行线性扩增, 有效减少了PCR指数扩增所造成的偏差, 但其扩增效率要远低于PCR扩增; 多重置换扩增技术是一种利用Phi29DNA聚合酶且不依赖PCR进行全基因组扩增的技术, 与PCR技术相比, Phi29DNA聚合酶强大的聚合能力使这种方法具有更高的覆盖率, 但是初期引物和模板结合的随机性导致MDA扩增会出现扩增偏倚。
为此, XIE课题组[22]于2012年提出了多重退火环状扩增循环技术, 这种技术首先进行MDA预扩增, 获得闭合的扩增产物环状分子, 然后再进行PCR扩增, 可以降低MDA的偏倚性, 同时扩增产物的覆盖度提高到了93％。2017年, XIE课题组又开创了一种新的单细胞基因组线性扩增技-LIANTI（linear amplification with transposon insertion）, 该方法利用含有可以线性扩增的T7启动子的转座子将基因片段化, 再进行线性扩增放大, 全程没有任何指数扩增步骤, 将覆盖率提高到了97％。
这些误差经过扩增后会被放大, 继而影响单细胞的测序数据, 干扰整体结果。一些研究对同一单细胞扩增产物进行点突变测序, 这种方法的缺陷是只能检测到子代测序错误, 无法检测到扩增过程中的错误。另一种策略是进行多单元来相互验证, 通过分析来自在3个或多个单元中的单碱基误差来检测误差, 但是这种方法只适用于通过克隆培养的细胞, 无法分析原代细胞以及细胞本身具备的SNV。要避免这种误差, 可以对单个细胞内的核酸进行多次重复测序, 在同一细胞内更准确地检测扩增误差, 以更精准的验证单细胞中的真实突变, 同时排除假阳性。
出自《单细胞测序技术在干细胞领域的研究进展》作者刘芳远,苏秀兰。
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