问：免疫荧光法是什么？2024-01-02 09:28:00
答：目前检测γH2AX最主要的方法是免疫荧光法。免疫荧光法的基本原理是利用γH2AX单克隆抗体作为一抗，与细胞DSB位点处的γH2AX特异性结合，再加入标记有荧光素的二抗，与一抗形成夹心结构，病灶可以通过免疫荧光标记可视化，利用荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜进行分析。早期研究大多采用人工计数在荧光显微镜下对γH2AX焦点进行定量观察，但这种人工计数方法不仅费时费力，还可能会导致误差，主要原因是在每个核的焦点数较高的情况下，密集和重叠的γH2AX病灶可能造成人工计数小于实际的焦点数。近年来，半自动化和全自动图像分析技术逐渐取代了传统的人工计数方法，能够快速检测和定量荧光图像大数据集中的γH2AX病灶。使用共聚焦激光扫描显微镜以及图像自动扫描和分析系统使γH2AX焦点定量变得更加快速和精确。但仅限于二维数据，在实际应用中只适用于计算靠近细胞核中段平面的焦点，而忽略了平面外的焦点。所以为了克服二维聚焦计数的局限性，Memmel等提出了一个开源3D焦点分析仪，用于共聚焦荧光显微镜获取的图像堆栈中γH2AX聚焦的自动三维分析。在开源3D焦点分析仪中的图像堆栈处理算法可以自动识别单个细胞核并计数DNA双链的数量，即荧光标记的γH2AX焦点，进而评估每个细胞核的总焦点数量，而且在激光扫描显微镜获得的3D图像堆栈中，不需要额外的细胞核染色。
出自《DNA损伤和修复中的H2AX磷酸化及其在生殖相关细胞中的作用》作者陈红,徐沛欣,王惠增.
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