通常，接种后早期需要保留一定的干细胞维持和促存活信号，以促进单细胞或小细胞团贴附、扩增和单层闭合；待单层基本连续后，再降低Wnt/R-spondin等干细胞维持信号，并根据模型用途调整EGF、Notch抑制剂、维生素D3或其他诱导因子，以促进吸收细胞、杯状细胞和其他成熟肠上皮谱系的形成。因此，增殖与分化的时序调控应视为2D屏障模型构建中的功能优化环节，不仅是培养基更换步骤。分化诱导的起始时间依据单层闭合状态和屏障稳定性确定。
 

若在细胞尚未充分铺展或局部仍存在裸露膜区时过早诱导分化，细胞增殖修复能力下降，容易造成单层闭合延迟、局部缺损和TEER波动；若长期维持扩增状态，则模型中干/祖细胞比例偏高，吸收细胞成熟不足，转运体、代谢酶及刷状缘相关标志物表达偏低，难以满足药物吸收评价的功能要求。Wang等指出，人肠道类器官可通过撤除维持干细胞状态的生长因子并加入谱系诱导因子，在约5 d内获得不同成熟细胞组成；但终末分化后类器官活性可在数天内明显下降，因此功能实验应在分化成熟与细胞状态稳定之间选择合适窗口。这一原则同样适用于2D屏障模型，即分化诱导应以单层连续性、TEER平台、细胞形态和功能标志物为依据进行动态判断。对于药物吸收评价模型，分化条件还需兼顾屏障稳健性和药物处置功能。
 

出自《小肠类器官来源屏障模型在药物吸收评价中的应用进展》作者张克霞，翟珊，张洲。