RT-PCR扩增IBDV基因组全长cDNA克隆的技术2022-02-11 09:33:09
1865年Gregor Johann Mendel的论文《植物杂交实验》奠定了经典遗传学的基础。经典遗传学从性状入手研究生命的遗传物质,而反向遗传学从遗传物质入手研究生命的基因结构和功能。1996 年,Mundt等启了IBDV反向遗传学研究的序章。2002年,国内浙江大学于涟教授课题组黄耀伟等率先开展 IBDV 反向遗传学研究。近年来,IBDV反向遗传学基于反向遗传操作系统、病毒基因功能、致病机制以及疫苗开发进行了大量研究探索。重组DNA技术的发展使得在分子水平分析和操作基因组成为可能,从而对基因组功能由更深入的研究。但非逆转录RNA病毒在复制周期中不包括生成 DNA 的阶段,因此对非逆转录 RNA 病毒进行基因组操作,只能先获得全长基因组cDNA。最终通过获得RNA病毒基因组感染性克隆(包括 cDNA 和体外转录的 RNA)在体内重新获得活的病毒,该过程被称作病毒拯救。由于IBDV基因组由两个节段的双链RNA组成,IBDV在复制时并不经历DNA阶段,因此对IBDV基因基因组操作必须先获得基因组全长cDNA。目前获得IBDV基因组全长cDNA的方法已经成熟。黄耀伟等报道了长距离RT-PCR扩增IBDV基因组全长cDNA克隆的技术。
高立等报道了分段扩增基因组节段再融合的方法获得IBDV全长基因组cDNA。本研究中,参考黄耀伟等建立的方法以及高立等建立的方法,通过将IBDV B87疫苗株基因组两个节段分段为A1、A2、B1 和 B2进行扩增,获得了IBDV B87疫苗株基因组的cDNA克隆。为了成功获得IBDV全基因组cDNA克隆,需要制备高滴度和高纯度的病毒样品。同时,使用蛋白酶K消化的方法提取病毒基因组RNA,有利于基因组B节段的扩增。
出自《传染性法氏囊病病毒分子流行病学及新型疫苗的研究》作者陈果。
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