模式动物果蝇中主要突变体的途径2023-02-03 09:00:57
两种系统的靶向性依赖于特异性结合DNA序列的蛋白模块，因此其构建成本高，操作步骤繁琐。与上面两种系统相比，2013年出现的CRISPR/Cas9技术具有显著的优势。CRISPR/Cas9来自于细菌与古细菌的获得性免疫系统，用于抵御病毒的侵染。当噬菌体入侵时，crRNA、tracrRNA与Cas9蛋白形成复合体，识别噬菌体DNA序列的前间区序列邻近基序（protospacer adjacent motif，PAM，序列为NGG三碱基区段），其中crRNA以碱基互补的方式与PAM相邻的DNA序列结合，使双链结构打开，tracrRNA激活Cas9切割活性，在PAM位点上游第三个核苷酸附近进行切割使DNA双链断裂，从而抵抗病毒入侵。基于此系统研发出的CRISPR/Cas9基因突变系统只包含两个重要成分，一个是具有DNA双链切割活性的Cas9蛋白，另一个是具有导向功能的sgRNA，Cas9蛋白可以与sgRNA结合，在sgRNA的引领下通过碱基互补配对靶向目的DNA，借助Cas9内切酶活性使靶位点发生DNA双链断裂，随后借助细胞的DNA修复引起基因突变，如细胞利用非同源性末端链接途径可使基因发生移码突变或片段缺失和插入，而利用同源重组修复途径通过提供供体 DNA 可实现基因的定点编辑或特定基因的插入。
目前，在模式动物果蝇中主要有4种基于CRISPR/Cas9构建突变体的途径：（1）卵中共注射Cas9mRNA和sgRNA；（2）卵中共注射两个可以分别表达Cas9和sgRNA的质粒；（3）在Cas9转基因果蝇卵中注射sgRNA质粒；（4）构建sgRNA转基因品系，然后和现存的Cas9转基因果蝇杂交。在这些方法中，方法的成本高，方法的突变效率低，方法获得突变体的时间长。相比之下，方法通过收集Cas9转基因果蝇卵，向其注射sgRNA质粒是最简单的突变体构建方式。
出自《模式动物果蝇的基因调控前沿技术》作者韩玉婷，许博文，李羽童.
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