对于sgRNA元件，其转录可由不同的启动子调控，比如U6a、U6b等，经过测试，用U6b调控sgRNA转录、nanos调控Cas9表达是构建果蝇突变体的最佳选择。基于此，清华大学果蝇中心已建立成熟的突变体构建体系：根据CRISPR/Cas9系统原理，选择PAM位点上游20nt序列作为sgRNA序列，也可利用网站设计，并合成相应的寡核苷酸链，通过退火形成双链DNA片段并与酶切后的载体连接，构建U6b-sgRNA质粒并测序确认，纯化后用注射缓冲液溶解；收集生殖细胞特异表达Cas9的nanos-Cas9转基因果蝇卵并注射U6b-sgRNA质粒，注射了质粒的果蝇为G0，G0与携带平衡子的果蝇杂交，其后代G1挑选携带平衡子的个体并进行PCR检测，筛选得到突变体，之后再经过遗传杂交去除Cas9，即可得到相应的突变体品系，突变体品系经过测序确认后，编号（TH代表清华，M代表突变）并存储资源库。经过系统分析发现，sgRNA质粒注射浓度会影响突变效率：浓度低，突变效率低，但浓度高，毒副作用大，所以一般选择其注射浓度约为75ng/μL。另外，sgRNA的GC含量也会影响突变效率，特别是临近PAM区域6个碱基的GC含量，与突变效率有极高的相关性，高突变率sgRNA，其GC含量往往大于60％。
 

出自《模式动物果蝇的基因调控前沿技术》作者韩玉婷，许博文，李羽童.