应细胞在体内的三维空间结构，因此贴壁培养难以很好地模拟在体组织结构特点。自Hans Clevers实验室建立起肠类器官培养技术以来，该技术被广泛应用。近来出现的脑类器官、肝类器官、肾类器官等类器官培养手段为体外研究特定组织和器官的三维结构、疾病发生、组织再生修复及药物评价提供了全新的体外研究模型。例如 MATANO 等培养了正常人结肠类器官，并使用 CＲISPＲ-Cas9 介导抑癌基因 APC、SMAD4、TP53和癌基因 KＲAS、PIK3CA 突变来研究结肠癌的病因，为体外研究结肠癌发病机制提供了一种全新模型。
 

获取肠类器官时，由于不同实验室在肠隐窝分离操作和培养过程中所用方法不尽相同，使得研究结果呈现出较大差异。此外，使用临床样本进行培养时，由于存在较大个体差异，难以保证实验结果的稳定性，所以有必要建立一种具有共同来源的肠类器官培养方法，于是我们提出是否能够利用已有的肠上皮细胞株进行 3D 培养来获取肠类器官。我们首先选取了目前广泛使用的 3 种肠上皮细胞株尝试培养肠类器官，发现只有结肠癌上皮细胞株 Caco-2 能够培养形成中空的肠类器官样结构。
 

不同细胞株形成肠类器官能力的差别主要取决于细胞自身特性。单个肠道干细胞具有体外形成类器官的能力，但本课题使用的正常肠上皮细胞 IEC-6 并未能培养出肠类器官，我们推测由于 IEC-6 胞质内有大量溶酶体且形态更加趋向于终末分化的肠上皮细胞，因此 IEC-6 细胞已不具备肠道干细胞特性从而导致其不能形成肠类器官。结肠癌组织分离得到的肠隐窝培养后所形成的类器官具有更强的增殖潜能，可形成具有更多更长隐窝凸起的肠类器官结构。因此，使用结肠癌细胞 Caco-2 能够培养获得肠类器官。尽管 CT26．WT 细胞株同样来源于结肠癌，但其为成纤维细胞样生长，已经不具备典型的肠上皮细胞特点，3D 培养时其难以形成肠类器官所需的肠上皮细胞之间的紧密连接，所以该细胞株不能培养形成肠类器官。
 

不同的培养体系会显著影响细胞的生物学特性。比较了贴壁生长和3D培养下 Caco-2细胞的肠道干细胞相关基因和细胞增殖标志物 Ki67的表达情况。实验结果证实，3D培养条件下 Caco-2细胞中肠道干细胞标志物 Lgr5 和 Olfm4 的 mＲNA 水平较贴壁培养时降低，这一结果提示 3D 培养时仅少量 Caco-2 具有干细胞特性，与在体条件下结肠干细胞含量较少的特点更为一致。3D培养时 Caco-2细胞的溶酶体分布非常接近在体肠上皮细胞溶酶体的分布特点。因此，Caco-2 肠类器官在细胞组成和亚细胞器分布等方面均较贴壁培养的 Caco-2 细胞更加接近在体状态。电离辐射能够引起 Caco-2肠类器官发生细胞凋亡，且具有剂量依赖性，所以Caco-2来源肠类器官具有和原代肠组织培养所得肠类器官相似的辐射敏感性。
 

由于目前尚无正常成年人来源肠上皮细胞株，采用了人结肠癌细胞株 Caco-2 来培养肠类器官。尽管在3D培养体系中该细胞能够形成肠类器官结构，且在干细胞相关基因表达、增殖能力和亚细胞器分布等方面和正常肠上皮和肠类器官具有很高的相似性，但该细胞内终究含有许多突变基因，因此，使用Caco-2 细胞培养肠类器官并进行相关评价时，还需对这一点进行充分考虑。综上，发现人结肠癌上皮细胞株 Caco-2 具有在3D培养体系中形成肠类器官的潜能，为后续进行胃肠道电离辐射生物学研究和抗结肠癌药物评价提供了一种新的体外研究模型。

 

出自《3D培养体系中不同肠上皮细胞株形成肠类器官潜能的比较及应用》作者欧静，徐珍妮，刘登群。