构建稳定细胞系生产rAAV病毒粒子2021-12-09 09:17:27
将AAV的rep、cap基因、携带ITR和目的基因的载体基因组和便于筛选的标记基因同时整合到细胞中构成细胞系,生产rAAV病毒粒子。1990年,Vicent等首先建立了整合AAV基因组的细胞系,他们用只包含rep及cap基因的质粒转染HeLa细胞,得到了几个整合了低拷贝AAV基因组的细胞系,由于缺失了 ITR,生产rAAV的能力较低;许多研究者采取其他策略来改进rAAV的生产,Gao等构建了携带腺相关病毒载体成分的重组腺病毒,并用自身启动子控制的含rep及cap基因的质粒转染HeLa细胞建立包装细胞系,然后通过辅助腺病毒和携带载体成分的重组腺相关病毒共同感染包装细胞系,从而产生rAAV病毒粒子;Farson等通过对载体和细胞培养条件进行优化,使宿主细胞适应无血清悬浮培养,最高可达15L的规模,实现了较大规模的生产。但在实际操作中,稳定细胞系的构建通常需要经过大量的筛选以及不断的鉴定,而且需要严格的生产能力评估才能得到符合要求的细胞系,其操作复杂性限制了其走向工业化。杆状病毒表达系统因其强启动子、可以对表达的蛋白进行加工修饰、且能够扩大生产规模,很早就被用来进行rAAV的生产,被EMA批准进入欧洲市场的Glybera就是用该系统生产的,常用苜蓿银纹夜蛾-杆状病毒表达系统和家蚕-杆状病毒表达系统。
苜蓿银纹夜蛾-杆状病毒表达系统早在几十年前,BEVS已被用于工业中大量生产重组蛋白,该表达系统被证明是一种经济可行的平台, 开始用于生产rAAV病毒颗粒。Urabe等在2002年建立了三杆状病毒表达系统,将rep、cap基因和rAAV的ITR序列及目的基因在草地贪夜蛾细胞系中分别由不同的3种重组杆状病毒载体来表达,且生产的病毒粒子结构、功能均正常,但是由于rep基因转录冲突的问题,整个生产系统不稳定,很难进行大规模生产;Smith等进行改进,设计出二杆状病毒包装系统,此系统只包含rep、cap基因和目的基因两个重组杆状病毒载体,不仅能更好的保持杆状病毒的稳定性,使得杆状病毒在昆虫细胞内复制的代数至少达到6代,同时还能提高了rAAV的生产效率;在此基础上,Galibert等开发出的单杆状病毒表达系统,将rep、cap基因和rAAV必需基因组分别插入AcNPV基因组的不同位点构建一个重组杆状病毒。
出自《腺相关病毒的生产方式及其在基因治疗中的应用》作者杜梦潭, 刘兴健, 胡小元。
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