目前DMD基因编辑的内切酶应用2022-01-10 09:39:25
CRISPR／Cas9系统是继大范围核酸酶、锌指核酸酶、转录激活因子样效应物核酸酶后，操作更简便、效率更高、成本更低、应用范围更为广泛的基因编辑工具。在细菌基因组中，CRISPR序列用于识别外源性DNA序列，CRISPR相关基因（Cas）表达产物可以切断外源性基因。基因编辑技术运用这种细菌免疫机制，将内切酶与向导核糖核酸（gRNA）相连接，通过病毒或非病毒载体导人细胞内，实现DNA精准识别、切割，并根据DNA模板产生同源重组（HDR）或非同源末端链接（NHEJ），进而修复DNA链。目前应用于DMD基因编辑的内切酶，包括金黄色葡萄球菌来源的SaCas9、化脓性链球菌来源的SpCas9和Cpfl；体外研究载体包括质粒、慢病毒、腺病毒，体内研究多为腺相关病毒载体。
DMD基因剪接在鼠和人类的保守性使其从动物实验推断人类疾病成为可能。自2016年开始，CRISPR／Cas系统逐渐在体外培养的肌卫星细胞、Duchenne型肌营养不良症患儿诱导型多能干细胞（iPSCs）、DMD基因缺陷小鼠中实现DMD基因编辑，并可见dystrophin蛋白水平恢复，部分骨骼肌和心肌肌力增强b4驯。目前，观察时间最长的动物实验是Hakim等b81进行的6周龄mdx小鼠模型研究，经mdx小鼠尾静脉注射AAV9 CRISPR／SaCas9基因，18个月后观察到mdx小鼠体内dystrophin蛋白水平升高，最高可达20％，肌力和心功能增强。对携带突变基因的胚胎进行基因编辑是避免形成突变嵌合体的关键，此外，AAV CRISPR．SaCas9基因可以使成年小鼠产生体液免疫和细胞免疫，降低基因编辑效率，对新生小鼠（出生后1—18天）即进行基因编辑可以有效减轻免疫应答Is9。
DMD基因剪接在鼠和人类的保守性使其从动物实验推断人类疾病成为可能。自2016年开始，CRISPR／Cas系统逐渐在体外培养的肌卫星细胞、Duchenne型肌营养不良症患儿诱导型多能干细胞（iPSCs）、DMD基因缺陷小鼠中实现DMD基因编辑，并可见dystrophin蛋白水平恢复，部分骨骼肌和心肌肌力增强b4驯。目前，观察时间最长的动物实验是Hakim等b81进行的6周龄mdx小鼠模型研究，经mdx小鼠尾静脉注射AAV9 CRISPR／SaCas9基因，18个月后观察到mdx小鼠体内dystrophin蛋白水平升高，最高可达20％，肌力和心功能增强。对携带突变基因的胚胎进行基因编辑是避免形成突变嵌合体的关键，此外，AAV CRISPR．SaCas9基因可以使成年小鼠产生体液免疫和细胞免疫，降低基因编辑效率，对新生小鼠（出生后1—18天）即进行基因编辑可以有效减轻免疫应答Is9。
出自《Duchenne型肌营养不良症基因治疗进展与思考》作者张成,林金福,廖子钰。
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