ELISA试剂盒对PCV2病毒抗体起阳性反应2022-02-16 09:16:42
TMB相比来说较稳定，可配制成母液放置1年以上，本试验选用TMB作为最终的酶反应底物，并确定了TMB底物的最佳孵育时间为15-20min。综上所述，本研究确立了PCV2血清中和抗体阻断ELISA试剂盒的组装参数为：改构马赛克Cap蛋白包被浓度为1μg/mL、4℃下包被 16h、酶标抗体6F8稀释度为 1:32000、封闭液为含10％小牛血清的PBST、封闭时间为4℃下封闭16h、猪血清稀释度为1:80、样品与酶标抗体反应温度均为37℃、各种抗体孵育时间1h、TMB 底物室温孵育时间15-20min。敏感性、特异性、批次稳定性、保存期是成熟的商业化试剂盒在研制中关注的四个关键点。本研究制备的PCV2血清中和抗体阻断ELISA试剂盒的检测敏感性是细胞中和试验的10倍，敏感度较高。ELISA试剂盒只对PCV2病毒抗体起阳性反应，与CSFV、PRV、PRRSV、FMDV、PPV 等病毒抗体均无反应，证明其具有良好的特异性，不会与 PCV2 病毒以外的其他病毒抗体有交叉反应。商业化的ELISA试剂盒要求批次间的变异系数不得大于10％，本试剂盒批内的变异系数为1.55％-2.52％之间、批间变异系数为3.15％-5.39％，均低于 10％，说明本研究制备的阻断试剂盒低于行业规定标准，批次间质量稳定可靠，具有良好的批次稳定性。
以细胞中和试验的结果作为标准，自建阻断 ELISA 试剂盒的敏感度为98.9％，特异性为78.9％，与细胞中和试验的符合率为93.3％。阻断 ELISA 特异性偏低可能是细胞中和试验对低效价中和抗体检测不敏感，误判为假阴性造成的。国外 ELISA 试剂盒的保存期一般在 1 年以上，如果保存得当甚至能达到2年以上，而国内 ELISA 试剂盒一般的保存期在半年左右，与国外相比还有较大差距。本研究采用加速试验对制备的 PCV2 血清中和抗体阻断ELISA试剂盒进行了保存期测试，结果表明37℃加速破坏14d试剂盒依然可稳定用于样品测试，根据37℃加速破坏1d相当于4℃条件下存放1个月计算，本研究制备的试剂盒可稳定保存1年以上。
综上所述，本研究建立的 PCV2 血清中和抗体阻断 ELISA 试剂盒生产工艺稳定，成品质量可靠，具备了商业化开发和临床推广应用的价值，为我国 PCV2 流行性病学调查、疫苗效果评估等提供了物质基础和技术保障。
出自《猪圆环病毒2型新型疫苗的研制及中和抗体快速检测方法的建立》作者侯竹美
