特异性TCR细胞疗法筛选2021-09-02 09:20:26
对已知抗原的TCR开发经典策略使用抗原肽或者携带有MHC-抗原肽复合物的细胞刺激外周血PBMC或者肿瘤中的TIL细胞，然后检测T细胞功能变化发现特异性T细胞克隆，从而获得TCR序列”1。具体过程主要包括抗原选取、pMHC构建、获得特异性TCR序列、TCR的功能优化、安全性评价等步骤。抗原的选择，对于已知抗原如EB病毒的LMP2蛋白可通过文献的调研获得，也可通过网站预测获得，不同人类白细胞抗原（HLA）对同一蛋白所呈递的抗原肽有所差别，因此在选择抗原肽的时候即需要确定所针对的HLA型。因正常外周血中存在的针对抗原特异性的T细胞数量极少，一般需要在体外进行刺激富集，特异性T细胞刺激和扩增及通过pMHC多聚体染色或者T细胞功能变化获得特异性TCR序列是整个开发中的关键步骤。刺激方法主要包括直接使用肽库刺激，使用原代DC细胞或者具有抗原呈递能力细胞系如EBV．LCL，K562等表达目的抗原基因或抗原肽冲击后进行刺激，但是肽库的合成及肽段的序列选择制约了肽库刺激方法的应用，因而利用细胞刺激PBMC方法被广泛应用。
刺激后特异性T细胞功能会发生变化，主要检测内容包括T细胞增殖、T细胞针对特应性抗原的细胞毒作用、放射性cr元素的释放、ELISpot及T细胞胞内细胞因子染色等，此外使用pMHC多聚体染色出阳性TCR也是常用的钓取TCR的方法。pMHC多聚体是TCR发现过程中十分重要的要素，也是近年来TCR发现过程中备受关注的环节。pMHC多聚体是一种可溶的MHC分子寡聚体，荧光标记的pMHC和流式细胞术相结合被广泛用来进行特异性TCR—T筛选。Joglekar等¨。
总结了pMHC发展历程，最初的单种pMI-IC只能呈递一种多肽，且构建过程较为复杂。Rodenko等使用条件型肽段，通过紫外照射置换肽段的方式大大降低了pMHC复合物生产的时间和工序。Hardrup等在一种pM—HC上使用多种荧光染料，通过不同荧光染料的组合可在同一份样品中检测与十几种甚至数十种pMHC复合物特异性结合的T细胞。Newwell等利用质谱流式技术，使用重金属离子作为标签标记pM—HC复合物，在一份样品中同时可检测针对109个pMHC复合物的样品。此外Bentzen等使用DNA．Barcode标记的pMHC多聚体在一个临床样本中检测了1 000多条肽段的特异性TCR细胞。将DNA．Barcode和荧光染料结合使用，通过测序技术可实现高通量的TCR序列分析。这种高通量筛选方法可提供更好了解TCR与pMHC之间相互作用的途径。此平台也可用来评价TCR的交叉识别，进行TCR的安全评价。
近年来，快速发展的微流控也逐渐被用于特异性TCR的筛选，通过油滴将单个T细胞与靶细胞包裹，利用NFAT—GFP信号指示出有特异性结合的细胞对，然后筛选出有信号的细胞对，进一步获得特异性序列。总的来说，使用pMHC多聚体进行TCR开发会遇到以下问题：①需要预知抗原信息。②肽段合成的通量。③pMHC多聚体合成（每个HLA型需要不同的多聚体及低亲和力肽段的合成）。④pMHC多聚体稳定性（MHC II）等。
出自《TCR,T细胞疗法的开发与产业化》作者芮魏，刘光娜，童丹
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