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DNA或RNA序列扩增2021-09-29 09:12:47

由于现阶段任何测序技术都无法直接对单个细胞提取的微量核酸进行检测,故必须通过全基因组扩增和全转录组扩增技术,获取到足量的核酸,从而构建DNA或RNA文库,为分析基因突变和拷贝数改变以及确定单个细胞中特定的细胞基因表达提供了基础。测序结果的正确与否取决于单细胞DNA和RNA扩增的数量和质量,所以DNA和RNA扩增方法的选择显得尤其重要。

全基因组扩增
将单个细胞的微量全基因组DNA进行扩增,通过外显子捕获进而高通量测序用于揭示细胞群体差异。常见的方法有聚合酶链反应法(PCR)、多重置换扩增技术(MDA)。PCR法是第一个针对SCS开发的方法但扩增效率低,MDA法已被广泛报道,从单细胞基因组或外显子组可以获得高的物理覆盖率(>90%),这是测量碱基突变的理想方法。近年,又有一种方法,Stepanauskas等提出了一种组合 MDA 和 FACS 并改进的方法,即WGA-X。该方法增强了单个微生物细胞和病毒基因组回收效率。
 
全转录组扩增技术
全转录组扩增技术是SCS的关键步骤,RNA测序的第一步是开发有效的全转录组扩增方法。单细胞转录组扩增的方法主要有唐氏法(Tang‘s method)、Smart-seq1、Smartseq2、线性扩增法等。但SMART技术不稳定,低水平表达的转录组可能会丢失。在过去的几年里,扩增技术取得了很大的进展,单个细胞转录组扩增技术中存在的弊端逐渐被修复。
 
基因测序
利用各种测序方法,分析DNA或RNA碱基序列、基因的表观遗传修饰。
 
数据分析
数据分析是指通过各种算法对测序结果进整理筛选,从测序结果中获取有用信息的一种方法。目前单细胞测序技术仍存在多种固有技术错误,改进生物信息学分析技术是关键。随着技术不断发展,SCS技术及其在肿瘤个体化治疗中的应用前景广泛。
 
出自《单细胞测序技术及其在乳腺癌中的应用进展》作者杜彦宏,季雄娟。