VPR系统可应用于模式动物果蝇体外细胞系2023-02-06 08:36:10
近年来，对CRISPR/dCas9系统的深入研究为转录激活系统的开发奠定了基础。通过对Cas9蛋白的内切酶活性位点进行点突形成dCas9，使其失去DNA双链切割能力，但仍可以与sgRNA结合，引起其构象的改变，如果dCas9羧基端融合转录激活因子，则能够在sgRNA引导下靶向特定位置并激活相应基因的转录。与构建CRISPR/Cas9突变系统类似，该激活系统也仅需20bpsgRNA就可实现基因的转录激活。为了在果蝇中建立CRISPRa系统，许多实验室进行了不同的尝试。VPR系统可应用于果蝇体外细胞系或个体体内，能够激活靶基因的转录并产生相应的发育表型，但其效率较低，且需要两个sgRNA才能完成对基因的激活，增加了载体构建的成本及时间，此外，应用时需要提前将两个元件（如Gal4和 UAS-dCas9-VPR、Gal4和sgRNA、UAS-dCas9-VPR和sgRNA）整合在果蝇上，整合周期长。为了进一步提高激活效率，降低毒副作用，简化遗传操作步骤，通过对比各种转录激活因子及其组合分析，清华大学果蝇中心主导研发了flySAM系统。此系统包括UAS-dCas9激活元件和sgRNA元件。对于UAS-dCas9激活元件，dCas9转录激活融合蛋白受Gal4/UAS二元系统调控，可以表达 dCas9-VP64和T2A介导的MCP-p65-HSF1。sgRNA元件除了有靶向目的基因的引导序列外，还有能被MCP识别的MS2序列。MCP序列能够结合MS2，因此在sgRNA的带领下，dCas9-VP64 结合到靶位点处，同时，MCP-p65-HSF1与MS2结合，从而增加了转录激活元件，提高效率。为了简化遗传操作的步骤，将以上两个元件整合到同一载体上，其注射产生的转基因品系直接与现存的Gal4品系杂交，一步实现基因表达的激活。
出自《模式动物果蝇的基因调控前沿技术》作者韩玉婷，许博文，李羽童.
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