然而,分化产生的这些细胞大多数为内层视网膜细胞,且几乎没有细胞表达成熟感光细胞标志物,如opsins。因此,在后续培养中,通过补充加入对早期感光细胞发育有促进作用的视黄酸与牛磺酸以提高表达有opsins的感光细胞数量。尽管已证实将2D培养产生的感光细胞移植到疾病鼠中可恢复部分视觉功能,但2D培养所产生的感光细胞仍缺少分化成熟的能力,尤其是无法形成感光细胞外节这一重要结构。 其次,2D培养分化产生的视锥和视杆细胞的数量及比例与体内分化相比仍有很大不同。 此外,无论是在2D贴壁培养组织或类胚体中,都没有正常的视网膜上皮细胞层结构,这也会影响感光细胞的正常发育。
 

为解决上述问题,2011年Sasai和David课题组提出了体外3D视网膜分化的方法。使干细胞在体外自发形成符合体内发育规律,具有生理结构的视网膜类器官。 不同实验室也对类器官分化方法进行了优化。其中,Zhong等解决了感光细胞分化的一个重要问题即体外感光细胞能够成熟并形成外节结构,并证实小部分感光细胞存在光反应,且不断有实验室报道在体外分化的感光细胞有纤毛结构以及早期外节的产生。因此可以证明,与2D培养相比,3D 体外培养已能够分化出视杯细胞及形成视网膜分层,并且随着类器官培养时间至数月时,可以产生多种细胞类型,包括感光细胞前体细胞以及包含外节的成熟感光细胞。 这对干性 ARMD 等视网膜退行性疾病中进行性萎缩退化的 RPE、神经视网膜以及脉络膜血管的替代治疗都十分重要。
 

因此,3D体外培养技术作为目前主要的细胞来源手段,对临床尤其是移植替代治疗的应用有着十分重要的意义。此外,随着体细胞重编程技术与基因编辑技术不断发展,我们可以将遗传性视网膜退行性病变患者的成体细胞重编程形成 iPSC,使之不仅能够产生重要的临床研究模型,并能分化为视网膜类器官用于药物筛选,并为感光细胞的移植治疗提供有效的资源。 其中,CRISPR/Cas9基因编辑技术在内在基因缺陷的修复方面发挥重要作用,使患者的 iPSC 能够成为重要的自体移植细胞来源。且最近研究发现,RNP CRISPR/ Cas9 技术能够更高效地进行基因的编辑并且脱靶效应更低,在临床应用中更有意义。
 

因此,与hESC来源的类器官移植相比,自体来源的iPSC分化形成类器官在移植替代治疗中最大的优势是减少了移植后的免疫原性。尽管目前这种方法成本非常高,但有研究发现主要组织相容性复合体匹配的患者在使用相同的iPSC后,会大大降低移植的成本与分化的可变性。因此,基因编辑后的类器官的产生能够有助于了解视网膜退行性疾病的发病与转归机制,从而为治疗提供新的思路。
 

出自《视网膜类器官治疗视网膜退行性疾病的研究进展》作者奚惠雨,茅希颖,孙洁。