非病毒载体递送系统在基因治疗中的创新应用2025-06-06 08:24:01
已报道LNP包装ABE-8emRNA体外成功校正镰状细胞病表型，聚合物纳米粒子包装肽核酸原位修复HBB基因IVS2-654突变。附加体载体不编码病毒蛋白，在核内以非整合的环状附加体形式存在，添加骨架/基质附着区元件和HBB基因复制起始区的EV已应用于临床前研究。另一项研究中，EV搭载人工转录因子Zif-VP64也可原位激活γ-珠蛋白转录。sgRNA与非目标位点错配，或Cas9识别相似的原间隔序列邻近基序，导致Cas9切割非目标位点即脱靶效应，可能引起意外的基因突变或功能改变。目前使用CRISPR/Cas9系统的产品，大多以非同源末端连接修复Cas9引入的双链DNA断裂。NHEJ脱靶率较高，若多个位点同时引入DSB则可能产生染色体重排、非整倍数变异、大片段丢失及染色体碎裂等严重后果。DSB和Cas9激活p53介导的DNA损伤反应，可能出现细胞周期停滞在G1期及p53缺陷细胞群的优势化克隆。可采用全基因组测序、GUIDE-seq、Digenome-seq等技术评估脱靶效应。
应用高保真Cas9变体如Sp Cas9-HF1、HiFi Cas9等，可大幅降低脱靶率；Cas9 nickase引入单链断裂而非DSB，工程化Cas9n可识别非NGGPAM，扩大编辑窗口；Cas12a的gRNA更短，非靶标错配少，可引入具有黏性末端的DSB；AsCas12f1核酸酶分子尺寸极小，更适配AAV载体。缩短sgRNA、提高编辑位点开放程度、诱导同源重组修复等方式也可降低脱靶率。现阶段的临床前研究聚焦于电穿孔转导Cas9/sgRNA-RNP复合物及HDR模板，实现HBB片段原位替换或校正多位点突变的复杂缺陷。
出自《地中海贫血基因治疗研究进展及思考》 作者:高欣洁，刘艳，王大威.
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